|
|
Optimization of recombinant protein production in animal cell culture
Kyselá, Hana ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík,, Mojmír (vedoucí práce)
The thesis describes successful transient transfections of suspension-adapted HEK 293 cells with linear polyethyleneimines (PEIs) in serum-free medium. The cells were transfected with pcDNA5/SEAP plasmid expressing the secreted form of human placental alkaline phosphatase (SEAP). SEAP concentrations in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. The goal of the thesis was to optimize various factors affecting transfection efficiencies, primarily the DNA:PEI ratio.
|
|
|
Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Šmíd, Jiří ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Optimalizace kultivačního média HEK293 buněčné linie
Čuperková, Romana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
HEK293 je lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin a je často využívaným systémem pro výrobu rekombinantních proteinů. Tato práce se zabývala optimalizací složení bezsérového média pro HEK293S a HEK293T linie za účelem náhrady drahých komerčních médií. Indikátorem byl růst kultury a exprese reportérových proteinů SEAP a GFP. Podařilo se mi vytvořit nové médium, které mimo jiné obsahovalo insulin (1 mg/l), transferin (5 mg/l) a směs stopových prvků. Při kultivaci ve směsi komerčního média EX-CELL 293 s mým novým médiem se buňky linie 293S množily rychleji než v komerčních médiích (doba zdvojení 20,47 ± 2,68 hodin (srel = 13,1 %)). Zdá se, že je nové médium vhodné také pro transfekci HEK293 linií a poskytuje relativně vysokou expresi rekombinantních proteinů. Transfekční poměr DNA:PEI (w/w) pro toto médium je 1:2 až 1:3.
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Šácha, Pavel (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Vývoj protokolu pro transientní transfekci buněčné linie HEK293 EBNA1
Šmíd, Jiří ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík, Mojmír (vedoucí práce)
Rekombinantní proteiny patří mezi důležité biofarmaceutické produkty používané v biomedicínském výzkumu a při léčbě lidských nemocí. Rekombinantní proteiny lze produkovat ve velkém množství stabilní transfekcí nebo rychlejší cestou přechodné transfekce s menšímy výtěžky. Pro zajištění správné biologické aktivity musí protein být náležitě poskládán a posttranslačně modifikován. Jelikož může být těchto modifikací dosaženo pouze expresí v savčích buňkách, staly se hlavním hostitelem expresí komplexních rekombinantních proteinů. V této diplomové práci je popsána přechodná transfekce buněk HEK 293 EBNA1 za použití lineárních polyethyleniminů (PEI). Tyto buňky byly předem adaptované na suspenzní kultivaci v médiu bez séra. Buňky byly transfekovány plasmidy pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO, všechny nesly reporterový gen SEAP. K porovnání účinností jednotlivých transfekcí byly měřeny koncentrace exprimované alkalické fosfatázy (SEAP) v buněčném supernatantu. Dalším faktorem, který byl optimalizován, byl použitý poměr DNA:PEI; rovněž byly vzájemně srovnány účinnosti transfekcí při použití dvou různých polyethyleniminů. Nejvyšší dosažená exprese byla 50 mg/l SEAPu při transfekci ve 24 jamkových deskách za poměru DNA:PEI 1:5. Při porovnání všech šesti plasmidů měl nejvyšší expresi plasmid pCEP4/SEAP a to i při převedení transfekčního systému do většího objemu.
|
|
|
Optimization of recombinant protein production in animal cell culture
Kyselá, Hana ; Španová, Alena (oponent) ; Ševčík,, Mojmír (vedoucí práce)
The thesis describes successful transient transfections of suspension-adapted HEK 293 cells with linear polyethyleneimines (PEIs) in serum-free medium. The cells were transfected with pcDNA5/SEAP plasmid expressing the secreted form of human placental alkaline phosphatase (SEAP). SEAP concentrations in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. The goal of the thesis was to optimize various factors affecting transfection efficiencies, primarily the DNA:PEI ratio.
|
host ::
RSS.